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中药野菊花中黄酮类物质的提取工艺研究

2016-01-31 21:27 字体:   打印 收藏 

摘要:目的确定提取野菊花总黄酮的最佳工艺条件,并精制以提高黄酮的含量。方法采用正交试验法,考察溶剂用量、乙醇浓度、提取时间以及提取次数对野菊花中总黄酮溶出量的影响,确定最佳提取条件,然后对野菊花总黄酮进行精制,用高效液相色谱测定已知黄酮的含量。结果在所考察的因素中,对野菊花总黄酮提取影响程度为乙醇浓度>提取次数>溶剂用量>提取时间,野菊花总黄酮最佳提取条件为12倍用量75%乙醇回流提取 2 次、每次回流1.5小时,精制后野菊花黄酮含量达到83.2%以上。结论该工艺设计合理,操作简单,生产成本低廉,有较高的工业生产应用价值。
关键词: 野菊花; 黄酮; 正交试验; 精制
引言
野菊花为菊科植物野菊Chrysanthemum indicum L.的干燥头状花序, 苦辛, 微寒, 归肝、心经, 清热解毒[1] 。野菊花的主要有效成分为挥发油及黄酮类化合物, 其中黄酮类化合物包括木犀草素、槲皮素、芹菜素、蒙花苷、刺槐素、金合欢素、异泽兰素等多种成分[2-5]。黄酮类化合物作为中草药中一种关键的药效成分,拥有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、降血脂等广泛的生物活性,天然黄酮主要以游离的苷元或与糖结合成糖苷的形式留于植物中。本文主要结合正交试验法考察溶剂用量、乙醇浓度、提取次数、提取时间得出野菊花总黄酮溶出量的影响,以得到最佳提取条件,并探究出野菊花黄酮的精制要点,为合理开发应用野菊花资源提供参考。
1 仪器、材料及试剂
岛津LC-10A高效液相色谱仪(LC-10ATVP泵,SCL-10AVP控制器,SPD-10AVP紫外检测器,CTO-10AVP柱温箱);紫外分光光度计(岛津UV3101PC);分析天平;旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂,RE-2000B);四用紫外分析仪。芹菜素和木犀草素标准品购于天津尖峰植物提取物公司,甲醇为色谱纯,提取及精制用乙醇、氯仿、乙酸乙酯均为分析纯,其他的化学试剂都是分析纯。野菊花植物购自国药控股福建有限公司中药部。
2 方法及其结果
2.1 野菊花总黄酮的测定
2.1.1标准的曲线:绘制[5]。结合紫外分光光度计的方法,在一定情况下适当调整,精密称定干燥至恒重的芦丁对照品2.0mg,加适当的甲醇溶解,定容到10ml便得出对照品储备液。精密吸取0.5,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0ml对照品储备液于50ml容量瓶中,加甲醇到20ml,根据比例放5%亚硝酸钠溶液2ml,摇晃均匀,闲置5min;加入10%硝酸铝溶液2ml,摇晃均匀,闲置6min,加入新调制的5%氢氧化钠溶液20ml,用甲醇定容到50ml处,吸光度要测定时,要把分光光度计至500nm处;同时结合浓度(C)及相应的吸光度(A)来回归分析,最终得到回归方程A=0.2458C+0.0362,r=0.9996。
2.1.2 样品总黄酮的测定:称取干燥野菊花粗粉100g,加入含溶剂的圆底烧瓶中,按表1的试验设计进行回流提取,过滤,取滤液挥干溶剂,残留物用甲醇溶解,定容到500ml,即得样品溶液,用分光光度计测定500nm处的吸光度值,由标准曲线计算样品总黄酮溶出量。
2.2 野菊花总黄酮的提取工艺考察:
2.2.1筛选因素水平:野菊花总黄酮采用醇提法。经预试验研究,提取过程中可能的影响因素包括溶剂用量(A)、乙醇含量(B)、提取次数(C)以及提取时间(D)。以野菊花总黄酮溶出量为考核指标,按4因素3水平进行正交试验,因素水平见表1。
1 因素水平表

    因   素    
水平 A溶剂用量(倍) B乙醇含量
(%)
C提取次数 D提取时间
(h)
1 4 65 1 0.5
2 8 75 2 1.0
3 12 85 3 1.5
 
 
2.2.2 正交试验设计及结果:按 L 9(43) 正交表对野菊花进行提取并测定总黄酮量, 结果见表 2和表3。
2 正交试验结果及分析

试验号 A B C D 总黄酮含量
(mg/g生药)
1 1 1 1 1 0.68
2 1 2 2 2 1.37
3 1 3 3 3 1.16
4 2 1 2 3 1.01
5 2 2 3 1 1.10
6 2 3 1 2 0.92
7 3 1 3 2 1.01
8 3 2 1 3 1.26
9 3 3 2 1 1.45
I 3.21 2.7 2.86 3.23  
II 3.03 3.73 3.83 3.3  
III 3.72 3.53 3.27 3.43  
R 0.69 1.03 0.97 0.2  
 
3 方差分析结果
方差来源 离差平方和 自由度 均方 F P
A 0.085 2 0.043 14.3  
B 0.199 2 0.099 33 >0.05
C 0.158 2 0.079 26.3 >0.05
D 0.006 2 0.003 1.00  
 
注:F0.05(2,2)=19.0, F0.01(2,2)=99.0, F0.005(2,2)=199.0
由表 2 和表3分析结果可知,在野菊花总黄酮的提取工艺中,各因素对提取效果的影响程度依次为B>C>A>D,且因素B(乙醇浓度)和C(提取次数)的影响具有统计意义,因此应选B2和C2,确定最优水平组合为A 3B2C2D3,即溶剂为12倍量的75% 乙醇回流提取 2次、每次1.5h。
2.2.3放大试验:称取三份野菊花干燥粗粉各500g,采用A 3B2C2D3最佳工艺条件提取,按2.1.2方法测定提取液总黄酮含量平均为1.72mg/g生药。提取液减压蒸去溶剂,60℃真空干燥72小时,称重提取物粗品,计算得此提取物中总黄酮质量分数为16%。
4 最佳工艺验证试验

试验批号 总黄酮含量(mg/g) 平均含量(mg/g)
20141002 1.72  
20141003 1.74 1.72
20141004 1.70  
 
2.3 野菊花黄酮的精制
野菊花黄酮的精制用溶剂抽提法。称取以上粗黄酮适当用量,结合3:2的重量比例来混入硅藻土,按序使用石油醚、氯仿、乙酸乙酯进行索氏抽提,分别抽提至无色,取乙酸乙酯溶液,减压蒸干得棕黄色固体则为精制的野菊花黄酮。
2.4 野菊花精制黄酮的鉴定
采用峰面积归一化法。以木犀草素和芹菜素混合溶液为对照品,以野菊花精制黄酮为供试品,分别进样高效液相色谱。以供试品中木犀草素与芹菜素的面积和与供试品出峰总面积的比值确定供试品中的黄酮含量。
色谱条件:色谱柱Diamonsil C18 (150mm×4.6mm,5μm);紫外检测波长283nm;流动相为甲醇-水溶液,按照甲醇含量 0~100%梯度洗脱;流速0.2ml/min;柱温为35℃。
对照品溶液的配制:精密称取木犀草素和芹菜素对照品各1mg,置10ml容量瓶中,加甲醇超声溶解,定容至刻度,即为对照品溶液。
供试品溶液制备:称取精制的野菊花黄酮约2mg,置10ml容量瓶中,加甲醇超声溶解,定容至刻度,即为供试品溶液。
吸取上述溶液5ul,分别进样高效液相色谱。色谱图如图1。经峰面积归一化法计算供试品中木犀草素与芹菜素的面积和与供试品出峰总面积的比值,计算得供试品中已知黄酮含量占83.2%。


 
   
3 结束语
野菊花的化学成分复杂,生物活性多样,可以开发成药品、保健品、饮品、食品添加剂、等多种产品。本研究以总黄酮溶出量为考核指标,野菊花用乙醇提取有利于黄酮类化合物的溶出,提高溶剂乙醇的浓度,可加快野菊花中总黄酮的溶出速度,从而使溶出量增加。但溶剂乙醇浓度过高时,黄酮物质的溶出量下降,这可能是溶剂乙醇浓度增加,反而使植物细胞脱水、皱缩,不易于溶胀破裂及总黄酮的溶出。结合正交设计得出优选的最佳因素水平为 12倍用量的75%乙醇溶剂回流提取 2次, 每次1.5 h。正交统计结果表明,提取时间因素的水平对总黄酮含量影响最小,从节能及经济效益考虑,样品的提取工艺最终采用每次提取1小时为佳。采用最佳工艺条件放大提取野菊花,所得提取物中总黄酮溶出量达1.72mg/g生药,总黄酮的质量分数占16%。
通常含有多种黄酮类物质,包括野菊花黄酮物质中有木犀草素、芹菜素及其糖苷等,精制后的野菊花黄酮成分含量占83.2%,达到新药研发的基本要求。药理学实验的结果表明木犀草素在体内具有多种药理活性,如降低血脂、抗过敏、降低胆固醇、抗菌、抗病毒等,芹菜素具有抑制致癌物质的致癌活性、抗炎症、抗病毒以及抗氧化等作用。笔者认为针对野菊花黄酮进行讨论与研究有一定的重要意义。并为从其植物中研发新型中药提供科学依据,有益于天然植物资源的有效利用。
参考文献:
[1] 张聪, 秦民坚, 王玉.野菊花的化学成分[ J] .药学与临床研究, 2009, 17(1):39.
[2] 崔兰冲, 李小芩, 韩莹, 等.HPLC测定野菊花中蒙花苷与木犀草素的含量[ J] .中国中药杂志, 2007, 32(1):33.
[3] 许雪琴, 余丽双, 陈国南.毛细管电泳-电化学检测测定野菊花中的黄酮类化合物[ J] .福州大学学报:自然科学版, 2008,36(6):884.
[4] 吕元琦, 李新民, 王月伶, 等.β-环糊精修饰区带毛细管电泳法测定野菊花中刺槐素、木犀草素和槲皮素[ J] .理化检验(化学分册), 2005, 7:464.
[5] 吴钉红,杨立伟,苏薇薇.野菊花化学成分及药理研究进展[J].中药材,2004,27(2):142.
[6] 汪丽燕,韩传环,王萍.木犀草素对冠脉血流动力的实验研究[J].中国药理学报,1992,8(5):388.
[7] 孙斌,等. 芹菜素的药理作用研究进展[J]. 中药材,2004, 27(7):531.
 

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